موش‌ها نیز مانند سایر حیوانات، احتیاج به تغذیه مناسب و جیره غذایی متعادلی دارند. موش‌ها در برابر کمبود غذا نسبت به حیوانات دیگر حساس‌تر هستند. مهم‌ترین علامتی که در کمبود غذایی مشاهده می‌شود لاغری مفرط، مرگ زودرس، اسهال و کانی بالیسم یا هم نوع خواری است. یک موش سفید بالغ به طور متوسط روزانه نیاز به ۱۰-۱۵ کالری انرژی دارد و روی این اصل مواد قندی قسمت اعظم غذای موش را تشکیل می‌دهد. از این میزان مواد قندی ۲۴-۲۶% آن را می‌توان از سلولز تأمین نمود. پروتئین‌ها با منشأ گیاهی یا حیوانی می‌توانند ۱۵ تا ۲۸% احتیاجات پروتئینی حیوان را تأمین کنند ولی مصرف بیش از حد ۲۸% پروتئین ممکن است عوارضی را در موش به وجود آورد. نسبت کلسیم به فسفر نباید از ۵/۱ کمتر و از ۵/۲ بیشتر باشد. موش قادر نیست ویتامین و اسیدآمینه مورد نیاز خود را در بدن بسازد و روی این اصل این ترکیبات را از طریق مواد خوراکی به بدن حیوان می‌رسانند.
فرآورده‌های غذایی موش به صورت پلت موجود می‌باشد. محتویات غذای موش معمولاً در برگیرنده حبوبات، مکمل‌های پروتئینی همانند سویا و شیر خشک، همچنین چربی به شکل روغن ذرت یا چربی‌های حیوانی، ویتامین‌ها و مواد معدنی است. غذای موش باید از یک سازمان یا فروشنده اسم و رسم دار خریداری شود که توجهات لازم را از نظر تهیه غذا‌های مقوی و بدون پاتوژن‌ها، هورمون‌ها، آنتی‌بیوتیک و سایر دارو‌های معمول داشته باشد. همراه بودن این ترکیبات با غذا ممکن است تأثیر شایان توجهی در نتایج آزمایش داشته باشد.
شکل ۳-۳٫ نحوه قرار گیری موش های آزمایشگاهی در قفس های مخصوص
۳-۱۴٫ اجرای الگوی زخم
موش‌هایی با وزن ۲۰-۳۰ گرم با تزریق داخل صفاقی کتامین و زایلیزین در طول مدت جراحی بیهوش گردیدند. متعاقب آن مو‌های قسمت پشتی موش‌ها به کمک خودتراش برقی تراشیده و توسط اتانول ۷۰% ضدعفونی شد. چهار زخم مدور یکسان با فواصل مساوی از یکدیگر در ناحیه‌ی پشتی موش‌ها توسط بیوپسی پانچر با ضخامت ۳ میلی‌متر ایجاد شد. الگوی زخم مورد استفاده برای این تحقیق بر اساس کار مورتون و مالون و به صورت excision wound model اجرا شد. بافت‌های پوستی با دقت تمام تشریح و خارج شدند و زخم‌های ایجاد شده در طول مدت تحقیق بدون هیچ پوششی باز ماندند. روز اجرای الگوی زخم به عنوان روز صفر زخم محسوب شد. ۲۴ ساعت بعد از روز اجرای الگو، دو تا از چهار تا زخمی‌که در سمت راست بدن موش‌ها ایجاد شده بود با لیپو پلی ساکارید تیمار شدند و دو تای دیگر هم که در سمت چپ بدن موش‌ها بودند به عنوان زخم‌های کنترل انتخاب شدند. این تیمار‌ها به مدت ۳ روز، در ساعت مشخص و توسط یک نفر صورت گرفت.

موش‌ها به چهار گروه مساوی که شامل پنج موش در هر گروه می‌شد تقسیم‌بندی شدند و هر موش به طور جداگانه در یک قفس مجزا قرار داده شد که در شرایط استاندارد و با تغذیه‌ی مناسب نگهداری شدند. گروه اول در روز اول بعد از اثر لیپو پلی ساکارید مورد بیوپسی قرار گرفت، گروه دوم در روز دوم پس از تیمار لیپو پلی ساکارید، گروه سوم در روز سوم و گروه چهارم هم در روز هفتم پس از تیمار لیپو پلی ساکارید مورد بیوپسی قرار گرفت. این نمونه‌های بافتی پوستی برای آزمایشات بیوشیمیایی و پاتولوژیکی آماده‌سازی شدند، به این صورت که یک زخم کنترل و یک زخم تیمار از یک موش به عنوان یک نمونه در روز مشخص برای بررسی پاتولوژیکی گرفته شد و همچنین یک زخم کنترل و یک زخم تیمار از همان موش به عنوان یک نمونه در روز مشخص برای بررسی‌های بیوشیمیایی انتخاب شد. تمام مراحل جراحی بر اساس کمیته‌ی اخلاقی انیستیتو پاستور ایران و تحت شرایط استاندارد صورت گرفت.
شکل ۳-۴٫ روز صفر پس از اجرای الگوی زخم
۳-۱۵٫ تیمار موضعی لیپو پلی ساکارید
به منظور بررسی پتانسیل التهابی لیپو پلی ساکارید به طریق invivo، محلول تهیه شده لیپو پلی ساکارید به مدت ۳ روز و ۲۴ ساعت بعد از اجرای الگوی زخم به صورت موضعی و مستقیماً به بستر زخم اثر داده شد. همانطور که قبلاً ذکر شد دو تا از چهار تا زخمی‌که در سمت راست بدن موش‌ها ایجاد شده بود، با دوز یکسانی از LPS (μg 100) مورد تیمار قرار گرفتند. گروه کنترل زخم‌ها هم به صورت موضعی به مدت ۳ روز و ۲۴ ساعت بعد از اجرای الگوی زخم در همان شرایط یکسان با PBS تیمار شدند.
روز اول

روز دوم روز سوم روز هفتم
شکل ۳-۵٫ روزهای مختلف پس از اجرای الگوی زخم
عکس ۳-۶٫ نحوه‌ی گرفتن بیوپسی از محل زخم و تقسیم‌بندی نمونه‌ها به منظور انتقال به آزمایشگاه‌های بیوشیمی ‌و پاتولوژی. نمونه‌های پاتولوژی در فرمالین ۱۰% و نمونه‌های مربوط به بخش بیوشیمی‌ در ازت مایع نگهداری شدند.
۳-۱۶٫ آماده‌سازی لیزات بافت
نمونه‌های بافت با بافر لیز کننده‌ای که حاوی فسفات بافر سالین (PBS 0.05% Tween20) و مهارکننده‌ی پروتئاز(pro-block cocktails anti-protease, manufacturers Gouldbio Inc. USA) بود هموژنیزه گردیدند. هر ویال پروبلاک با ۵۰۰ ماکرولیتر از diluter موجود در کیت حل شد و به ازای هر ۵۰۰ ماکرولیتر از آن، ۵۰ میلی‌لیتر بافر PBS استفاده شد. همچنین لازم به ذکر است که به ازای هر ۱/۰ گرم از بافت پوست، ۱ میلی‌لیتر از بافر PBS حاوی پروبلاک استفاده شد. سپس بافت‌های حاوی بافر لیز کننده در دستگاه هموژنایزر ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه هموژن شدند. بافت‌های هموژن شده به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۴۰۰۰rpm سانتریفیوژ شدند و سوپرناتانت‌های حاصل به منظور اندازه‌گیری NO، H₂O₂، COX-2 جمع‌ آوری گردیدند.
۳-۱۷٫ تعیین میزان نیتریک اکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده
سنجش نیتریک اکسید به کمک کیت رنگ سنجی (Nitric Oxide assay kit, Biovision, Ca, USA) انجام گرفت. با توجه به اینکه نیمه عمر نیتریک اکسید کم بوده و ناپایدار است سریعاً به نیتریت و نیترات، اکسید می‌شود. که این محصولات برای تعیین میزان نیتریک اکسید مد نظر قرار می‌گیرند. اساس این کیت در دو مرحله خلاصه می‌شود. در مرحله‌ی اول نیترات توسط نیترات ردوکتاز به نیتریت تبدیل می‌شود. در مرحله‌ی دوم با بهره گرفتن از معرف گریس^[۱۰۵]، نیتریت به ترکیبی با رنگ ارغوانی تبدیل می‌شود.
۳-۱۷-۱٫ آماده‌سازی نمونه‌ها:
۸۵ ماکرولیتر از نمونه‌ها برای هر سنجش استفاده شد که دو مرتبه باید انجام می‌گرفت. در صورتی که کمتر از این مقدار استفاده شود باید با بافر حجم آنها را به ۸۵ ماکرولیتر رساند. برای هر نمونه یک بلانک در نظر گرفته شد.
۳-۱۷-۲٫ روش کار:
برای بلانک‌های هر نمونه (با حجم ۸۵ ماکرولیتر) مقدار ۱۱۵ ماکرولیتر از بافر اضافه شد. برای نمونه‌ها ۵ ماکرولیتر از نیترات ردوکتاز به هر چاهک اضافه شد. سپس ۵ ماکرولیتر کوفاکتور آنزیم به هر چاهک اضافه شد. پلیت مربوطه پوشانده شد و به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق انکوبه گردید تا نیترات به نیتریت تبدیل شود. سپس ۵ ماکرولیتر از تقویت کننده^[۱۰۶] به هر چاهک اضافه شده و به مدت ۱۰ دقیقه انکوبه شد. در مرحله‌ی بعد ۵۰ ماکرولیتر از معرف گریس R₁ و ۵۰ ماکرولیتر هم از معرف گریس R₂ به هر چاهک اضافه شد. بعد از ۱۰ دقیقه تغییر رنگ مشاهده می‌شود. این تغییر رنگ تا یک ساعت پایدار می‌باشد. میزان جذب توسط پلیت ریدر و در طول موج ۵۴۰ نانومتر خوانده شد.
۳-۱۸٫ تعیین میزان هیدروژن پراکسید برای نمونه‌های بافتی لیز شده
سنجش پراکسید هیدروژن با کیت کلرومتریک(Hydrogen peroxide assay kit, Biovision, Ca, USA) انجام گرفت. اساس این کیت بر این قرار است که در حضور HRP^[107]، OxiRed^TM Probe با هیدروژن پراکسید وارد واکنش شده تا محصولی رنگی با بیشینه طول موج ۵۷۰ نانومتر تولید شود.
۳-۱۸-۱٫ آماده‌سازی نمونه‌ها:
سوپرناتانت جمع‌ آوری شده از بافت هموژن شده (حاوی ۶-۸/۰ میکرومولار H₂O₂) به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۰۰۰g سانتریفیوژ شده و تکمه یا پلت سلولی حذف می‌شود. نمونه‌های لیزات بافت باید توسط فیلتر چرخشی^[۱۰۸] kDa MW (Biovision, Cat 1997-25)10 فیلتر می‌شدند تا تمام پروتئین‌ها خارج شوند. سپس در دمای ۸۰- درجه نگهداری شدند. ۵۰-۲ ماکرولیتر از نمونه‌ها به هر چاهک ریخته شد و حجم آنها با بافر به حجم ۵۰ ماکرولیتر رسانده شد.
۳-۱۸-۲٫ منحنی استاندارد H₂O₂
۱۰ ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید^[۱۰۹] (۰/۸۸) در ۸۷۰ ماکرولیتر آب مقطر حل شد تا استاندارد هیدروژن پراکسید (۰/۱mM) ایجاد شود. سپس ۱۰ ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید (۱۰mM) را در ۹۹۰ ماکرولیتر آب مقطر حل شد تا استاندارد هیدروژن پراکسید (۰/۱mM) ایجاد شود. مقادیر ۰، ۱۰، ۲۰، ۳۰، ۴۰، ۵۰ ماکرولیتر از استاندارد هیدروژن پراکسید (۰/۱mM) دو مرتبه در چاهک‌های پلیت ۹۶ خانه ریخته شد تا مقادیرnmol 0، ۱، ۲، ۳، ۴، ۵ در هر چاهک ایجاد شود.
۳-۱۸-۳٫ مخلوط واکنش:
برای هر چاهک ۵۰ ماکرولیتر از مخلوط واکنش^[۱۱۰] آماده شد که شامل ۴۶ ماکرولیتر بافر، ۲ ماکرولیتر محلول OxiRed^TM Probe و ۲ ماکرولیتر محلول HRP بود. ۵۰ ماکرولیتر از مخلوط واکنش به چاهک‌های حاوی نمونه و استاندارد هیدروژن اضافه شده، به خوبی مخلوط شده و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه گردیدند. سپس میزان جذب نوری (OD) آنها در طول موج ۵۷۰ نانومتر توسط میکروپلیت ریدر اندازه‌گیری شد.
۳-۱۹٫ اندازه‌گیری سطح آنزیم COX-2 برای نمونه‌های بافتی لیز شده
به هر یک از چاهک‌های پلیت ۹۶ چاهکی، µl 100 از استاندارد‌های تهیه شده و همچنین نمونه‌ها به صورت دو بار تکرار اضافه و در دو چاهک نیز به عنوان استاندارد ۰، µl 100 بافر بدون استاندارد ریخته شد.به منظور مخلوط کردن محتویات چاهک‌ها، پلیت به مدت چند دقیقه به آرامی‌تکان داده شد و پس از آن سطح پلیت را پوشانده و نمونه‌ها در درمای  به مدت ۱ ساعت انکوبه گردیدند. پس از آن محتویات چاهک‌ها خالی شده و هر یک از چاهک‌ها شش مرتبه و هر مرتبه با µl 200 بافر شستشو شسته شد. سپس در مرحله آخر پلیت را به آرامی‌برگردانده تا باقیمانده محلول شستشو تخلیه گردد. پس از این مرحله، µl 100 آنتی‌بادی نشاندار به تمام چاهک‌ها بجز چاهک بلانک اضافه شده و پس از پوشاندن سطح پلیت، نمونه‌ها به مدت ۳۰ دقیقه در  انکوبه شدند. دراین فاصله ۳۰ دقیقه‌ای محلول سوبسترا آماده شد. پس از این مرحله مجدداً تخلیه چاهک‌ها و شستشو انجام شد. چاهک‌ها ۹ بار و هر بار با µl 200 محلول شستشو شسته شده و پس از آخرین مرحله، با برگرداندن پلیت به آهستکی از تخلیه تمام محلول شستشو در چاهک‌ها اطمینان حاصل شد. به هر چاهک µl 100 سوبسترای TMB اضافه گشته و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق در تاریکی انکوبه شد. پس از گذشت ۳۰ دقیقه، با افزودن H₂SO₄ ۱۰۰µl به هر یک از چاهک‌ها، واکنش خاتمه یافته و پس از صفر کردن دستگاه با کنترل، جذب نوری نمونه‌هادر ۴۵۰nm قرائت گردید. با به دست آوردن OD نمونه‌ها، میانگین OD خالص به شیوه زیر محاسبه و پس از رسم منحنی استاندارد، غلظت COX-2 در نمونه‌های مجهول محاسبه گردید.
میانگین OD خالص= میانگین OD نمونه‌ها- میانگین OD بلانک
۳-۲۰٫ بررسی هیستوپاتولوژیکی بافت‌های زخم شده
به منظور آنالیز هیستوپاتولوژیکی، در هر کدام از روز‌های ۱، ۲، ۳ و ۷ تعداد ۵ سر موش انتخاب شد. برای گرفتن بیوپسی از محل زخم، موش‌ها با تزریق داخل صفاقی کتامین و زایلیزین در طول مدت جراحی بیهوش گردیدند. بیوپسی به طریقی گرفته شد که نمونه‌ها از قسمت اپیدرم، درم و بافت شل زیر جلدی بود. پس از جراحی موش‌ها به صورت جداگانه در هر روز، نمونه‌های بافتی بدست آمده به طور جداگانه هر کدام در فرمالین ۱۰% نگهداری شدند. نمونه‌ها به آزمایشگاه پاتولوژی منتقل شدند تا رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین ائوزین^[۱۱۱] (H&E) برای آنها صورت گیرد. عمل آبگیری با سری‌های الکل انجام شد، عمل پاکسازی با گزیلن و قالب‌گیری در موم پارافین صورت گرفت. لایه‌های ۶-۴ میکرومتر تهیه شده و عمل رنگ‌آمیزی انجام شد.
۳-۲۱٫ آنالیز آماری
آنالیز آماری داده‌ها توسط نرم‌افزار SPSS ورژن ۲۰ انجام شد. میزان نیتریک اکسید، سیکلواکسیژناز و هیدروژن پراکسید بین نمونه‌های شاهد و تیمار با آزمون ANOVA tTest آنالیز شدند. میزان Pvalue˂۰٫۰۵ به عنوان تفاوت معنادار بین گروه‌ها شناخته شد. در بررسی اثر بخشی دوز LPS از آزمون آماری آنالیز واریانس یک طرفه^[۱۱۲] استفاده شد. برای این منظور، تمامی‌مشاهدات تیمار بر اساس دوز استفاده شده در گروه ­های مختلف قرار گرفتند. در بررسی اثر LPS بر آنزیم­ها در زخم موش­ها از آزمون آماری t زوجی^[۱۱۳] استفاده شد. داده‌ها بر اساس میانگین ±انحراف معیار نشان داده شده‌اند.
فصل چهارم
نتایج
۴-۱٫ بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از ۲۴ و ۴۸ ساعت)
تعداد سلول‌های فیبروبلاست در محیط کشت اگر از یک میزانی بیشتر شود به سبب تولید متابولیت‌هایی مانع از رشد سلول‌های همجوار خود در محیط می‌شوند، بنابراین باید اپتیمم میزان سلولی رعایت شود. به منظور مشخص کردن تعداد سلول‌های بهینه‌ی مورد نیاز برای آزمایش، قبل از تیمار، سلول‌های فیبروبلاست در تعداد‌های مختلف از ۱۰^۴×۸ تا ۱۰^۲×۶۵/۱ در پلیت‌های ۹۶ خانه به مدت ۲۴ و ۴۸ ساعت کشت داده شدند. میزان پرولیفراسیون سلول‌ها با تست XTT اندازه‌گیری شد. نتایج نشان داد که برای پلیت مربوط به ۲۴ ساعت، تعداد سلول بین ۱۰ تا ۲۰ هزار (میانگین ۱۵ هزار) و برای پلیت مربوط به ۴۸ ساعت، تعداد سلول بین ۵ تا ۱۰ هزار سلول (میانگین ۷۵۰۰) اپتیمم تعداد سلول برای انجام آزمایش است. البته برای جبران محیط کشت اضافه شده توسط LPS به هر چاهک تعداد سلول‌های مورد نیاز برای مرحله‌ی تیمار دو برابر محاسبه شد.
نمودار ۴-۱٫ بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از ۲۴ ساعت)
نمودار ۴-۲٫ بررسی میزان حیات سلول‌ها بدون تیمار LPS (بعد از ۴۸ ساعت)
۴-۲٫ بررسی اثر LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌های فیبروبلاست با بهره گرفتن از روش XTT
جهت بررسی اثرات دوز‌های مختلف LPS بر میزان حیات سلول‌ها، غلظت‌های مربوطه به محیط کشت سلول‌ها اضافه گردید و سلول‌ها در مدت زمان‌های ۲۴، ۴۸ و ۷۲ ساعت انکوبه شدند. و میزان پرولیفراسیون سلول‌ها با بهره گرفتن از روش XTT اندازه‌گیری شد. همان طور که در نمودار ۳ و ۴ نشان داده می‌شود، اثرات LPS بر میزان پرولیفراسیون سلول‌ها، وابسته به دوز و زمان است. بدین ترتیب که در گروه اول که تیمار LPS برای آنها بلافاصله انجام گرفت، تا ۲۴ و ۴۸ ساعت تفاوت معناداری در تعداد سلول‌ها مشاهده نشد ولی بعد از ۷۲ ساعت انکوباسیون تفاوت معنادار در افزایش پرولیفراسیون سلول‌ها مشاهده گردید (P-value=0.050). برای گروه دوم که تیمار LPS برای آنها ۲۴ ساعت بعد از کشت سلول‌ها بود، در پلیت ۲۴ ساعته غلظت مربوط به ۳۱٫۶ µg/ml بیشترین اختلاف معناداری (P-value=0.001) در مقایسه با کنترل داشت، در پلیت ۴۸ ساعته غلظت مربوط به ۳٫۱۶µg/ml بیشترین اختلاف معناداری (P-value˂۰٫۰۰۱) در مقایسه با کنترل داشت، در پلیت ۷۲ ساعته غلظت مربوط به ۱۰۰ng/ml از LPS بیشترین اختلاف معناداری را نشان داد (P-value˂۰٫۰۰۱).
۴-۳٫ ارتباط دوز LPS با اثر LPS بر فیبروبلاست در گروه اول (بررسی اثر LPS بر فیبروبلاست بلافاصله)
با بهره گرفتن از آزمون آماری آنالیز واریانس یک طرفه^[۱۱۴] (ANOVA) اثر میزان دوز LPS بر فیبروبلاست بررسی گردید.
گروه اول. (۱۶ بار تکرار)
۲۴ ساعت: اثر بخشی LPS با مقدار دوز LPS ارتباط معنادار ندارد (p-value=0.931).
۴۸ ساعت: اثر بخشی LPS با مقدار دوز LPS ارتباط معنادار ندارد (p-value=0.065).